Transgenomic WAVE: nagy érzékenységű mutációdetektálás

A nagy érzékenységű mutáció detektálás a genetikai változatosság tanulmányozásának kulcsfontosságú eszköze. A hagyományos módszerek mellett (SSCP, CSGE, DGGE) a WAVE rendszerekben alkalmazott denaturáló HPLC-t a módszer érzékenysége, egyszerűsége, költséghatékonysága és automatizálhatósága teszi vonzóvá

A DHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography) egy olyan nukleinsav elválasztásra specializált HPLC, ami a felvitt nukleinsavat részlegesen denaturált állapotban választja el: a genetikai variációk jelenléte nagyon nagy pontossággal és érzékenységgel mutatható ki hőmérséklet modulált heteroduplex analízissel. A módszer egyben nagyon egyszerű és kényelmes - a minták közvetlenül PCR elegyből vizsgálhatók, további tisztítás nélkül. Az alkalmazások többségéhez semmiféle jelölő módszerre sincs szükség.

Hogy működik a csalhatatlan módszer?

1. A vad és mutáns/polimorfizmust mutató allélt polimeráz láncreakcióban külön-külön felszaporítják.

2. A reakciótermékeket összekeverik.

3. A keveréket melegítéssel denaturálják.

4. A vad-mutáns termék-keveréket visszahűtik.

A lehűlés során a szabályosan párosodott kettős szálú DNS-ek mellett heteroduplexek is keletkeznek.

5. A mintát a TEAA-t tartalamzó pufferrel mosott, a részleges denaturációhoz szükséges hőmérsékletre beállított NucleicSep oszlopra felviszik.

A TEAA az oszlop hidrofób gyöngyeihez kötődik, a DNS negatívan töltött foszfát gerince pedig az oszlophoz kötődött TEAA ammónium csoportjaihoz.

Az eluáló puffer acetonitril koncentrációját fokozatosan növel

6. Az eluáló pufferben folyamatosan növekvő mennyiségű acetonitril hatására TEAA-DNS kölcsönhatás gyengül, és a fragmentek lemosódnak a töltetről.

A mutációs helyeken hibásan párosodó, gyengébben kötődő heteroduplexek elsőként eluálódnak, majd ezeket követik a homoduplexek. A minta abszorbanciáját mérő UV detektorban az oszlopról hamarabb eluálódó heteroduplexek adnak legkorábban jelet.

A folyamatot (angol nyelvű) flash animációként meg is tekinteheti: How WAVE works